犊牛腹泻是养牛过程中的一种常见病和多发病，主要由病毒、细菌和寄生虫等感染引起；其中由病毒引起的腹泻危害最大且最难防治。在我国引起病毒性腹泻的常见病原为牛肠道病毒（BEV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛轮状病毒（BRV）和牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等。病毒感染不仅会导致腹泻，还会使机体产生多种并发症，严重时可导致犊牛死亡，且感染后终身排毒，严重影响全球畜牧养殖业的健康发展，造成养牛业经济衰退。BEV、BCoV和BRV感染后的临床症状高度相似，仅通过临床诊断很难确诊，需要配合实验室检测确定病原。因此，急需建立一种精准、特异性强、灵敏度高的定量检测方法，来实现对以上病毒的检测和及时防控。
微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是数字PCR中应用最广泛的一种技术，是在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，其过程主要包括样本微滴生成、微滴PCR扩增和荧光信号读取。在样本微滴生成时，将待检样本PCR体系利用“油包水”技术分布到上万个独立的反应室中，使样本分离为单个的核酸分子，每个微滴都是一个PCR体系。微滴PCR扩增反应结束后，应用微滴分析仪收集荧光信号，利用泊松分布的公式得出核酸分子的拷贝数或浓度，从而达到绝对定量。微滴式数字PCR的优点在于高灵敏度、抗干扰能力强、无需标准曲线、缩短了样品处理时间以及比qPCR更低的检测限度，使其在动物疫病传播规律、快速精准检测及风险评估等系统性应用中具有广泛的应用前景。
新疆农业大学动物医学学院史慧君教授团队在Frontiers in Veterinary Science（3.20，Q1）发表了一篇题为Establishment and Application of Multiplex Droplet Digital PCR Assay for bovine enterovirus, bovine coronavirus, and bovine rotavirus的研究论文，该研究建立了一种同时检测BEV、BCoV和BRV的ddPCR检测方法，检测灵敏度提高了370~1000倍。
在该研究中，研究人员基于病毒基因组的保守区域设计了特异性引物和探针，建立优化了检测BCoV和BRV的双重ddPCR，以及检测BEV、BCoV和BRV的多重ddPCR。结果表明，qPCR的检测下限为1000 copies/μL，而ddPCR对BEV、BCoV和BRV的检测下限分别为2.7 copies/μL、1 copies/μL和2.4 copies/μL。研究团队对某养殖场出现腹泻的82份犊牛粪便样本进行检测，双重ddPCR结果显示BCoV、BRV和BEV合并感染的检出率分别为18.29%、14.63%和6.1%。qPCR结果显示BCoV、BRV和BEV合并感染的检出率分别为10.98%、12.2%和3.66%。对另一养殖场68份样本进行检测，qPCR显示BCoV、BRV、BEV和BCoV与BEV共感染的检出率分别为14.49%、1.45%、5.80%和1.45%，多重ddPCR检测显示BCoV、BRV、BEV、BCoV和BEV共感染、BRV和BEV共感染的阳性率分别为14.49%、2.9%、8.7%、2.9%和1.45%。对另一养殖场的93份样本进行检测，qPCR显示BCoV、BRV、BEV以及BCoV和BEV的共感染检出率分别为5.38%、1.08%、18.28%和1.08%，多重ddPCR检测BCoV、BRV、BEV、BCoV和BEV共感染、BRV和BEV共感染的检出率分别为5.38%、2.15%、20.45%、1.08%和1.08%。以上结果表明，优化的双重和多重ddPCR方法比传统的qPCR方法更灵敏，特异性更强。
Sensitivity of the ddPCR assay
Results of clinical samples tested by duplex and multiplex ddPCR
综上所述，该研究在单重ddPCR系统的基础上优化出一种多重ddPCR检测方法，该检测方法的特异性强、敏感度高、并且能够同时检测BEV、BCoV和BRV，不但可以减少检测过程中的假阳性和假阴性，还有助于开发更好的诊断方法。
新疆农业大学动物医学学院陈俊贞博士和李丹硕士为该文的共同第一作者，付强教授和史慧君教授为共同通讯作者。
该研究受到自治区杰出青年基金项目（2022D01E15）、自治区重大科技专项（2020A01001-2）和国家自然科学基金项目（32260881）等资助。